人間のヒ素暴露のバイオマーカーとしての爪サンプルの応用

Scientific Reports volume 12、記事番号: 4733 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究では、人間の暴露のバイオマーカーとして、飲料水摂取によるヒ素摂取と爪中のヒ素濃度との関係を評価しました。 この目的のために、我々はイラン西部、カブードラハン県のヒ素の影響を受けた農村地域の健康な参加者40人から爪のサンプルを収集した。 ヒ素による飲料水源の汚染が報告されていない地域に住んでいた個人からも、合計 49 個の爪サンプルが収集されました。 ヒ素汚染村と参照村から採取されたサンプルの 50% と 4.08% の爪のヒ素含有量が、それぞれ爪の通常のヒ素値 (0.43 ～ 1.08 μg/g) よりも高かったことが判明しました。 調整重回帰の結果に基づいて、地下水と爪のヒ素濃度の間に有意な関連性が見出されました (p < 0.001)。 さらに、爪サンプル中のヒ素と性別との間に統計的に有意な関連性が示されました (p = 0.037)。 爪のヒ素含有量は、年齢、喫煙習慣、BMIなどの他の変数によって有意な影響は受けませんでした（p > 0.05）。 この研究結果を踏まえると、採取が容易で外部汚染のリスクが少ない爪組織などの生物学的指標の使用は、汚染地域における重金属への曝露を評価するのに適している。

ヒ素は、自然活動および人為的活動によって飲料水源で発生する危険な半金属の 1 つと考えられています。 除草剤、殺虫剤、木材防腐剤の使用、金属製錬業などの人為的活動、および地熱過程、火山噴火、鉱物の風化などの自然発生源によるヒ素暴露は、堆積物、土壌、土壌などの地下環境における広範なヒ素汚染につながります。地表水と地下水源1、2、3、4、5。 国際がん研究機関 (IARC) および米国環境保護庁 (USEPA) によってヒトの発がん物質として認識されているこの半金属は、有機および無機の形態で存在し、さまざまな酸化状態 (- 3、0、+ 3、+) で存在します。 5) 環境内6,7。 飲料水源の消費による無機ヒ素（亜ヒ酸塩およびヒ酸塩）への非職業的曝露は、曝露された人間集団に発がん性および非発がん性の健康影響を引き起こします3,8,9。 ヒ素曝露による人間の健康への急性および慢性の影響には、皮膚病変、心血管疾患、貧血、腎障害のほか、呼吸器疾患、さまざまな種類のがん（肺、皮膚、肝臓、腎臓、膀胱）が含まれます10、11、12。 したがって、飲料水の健康を確保するために、世界保健機関はヒ素の最大許容レベルを 10 μg/L と推奨しています13,14。 さらに、ヒ素は環境中に広範囲に存在し、人間の健康に悪影響を与える可能性があるため、自然および人為起源による人間の曝露を評価する毒物学的研究において、汚染物質の生物学的モニタリングが非常に重要です。 生物学的モニタリングには通常、人体から体液や組織を収集し、それらを分析して化学物質やその代謝物を特定することが含まれます 15,16。 ヒ素およびその化合物に対する人間の曝露モニタリングを特定および評価するためのバイオマーカーがいくつかあります。 血液、尿、毛髪、爪は、疫学研究においてヒ素曝露を評価するための簡単にアクセスできるバイオマーカーとして特定されています17。 これらの生物指標のうち、血液および尿サンプルで測定されたヒ素の量は、最近のヒ素摂取を示しており、尿サンプルでは約 4 日、血液サンプルでは 2 ～ 6 時間程度です 18。 一方で、収集した尿サンプルを凍結する必要性、血液サンプル収集方法の侵襲性、およびこれらのサンプルに関連する保管の問題は、これらのバイオマーカーの使用に関連する重大な欠点です19。 一方、毛髪や爪のサンプルで測定されたヒ素の量は、体液に比べて長期間（3～6か月前）の曝露を反映しています。 このため、特に飲料水の摂取を通じて高レベルのヒ素に長期間曝露された集団では、これらのバイオマーカー（毛髪と爪のサンプル）が曝露レベルを定量化するために使用されます18,20。 飲料水を通じて消費されたヒ素のほとんどは、曝露後 1 ～ 3 日以内にメチル化ヒ素として排泄されることに注意する必要があります。 しかし、体内に吸収された無機ヒ素の一部はスルフヒドリル基に結合する高い親和性を持ち、爪や髪などのケラチンの密な組織に蓄積します18,21。 バイオマーカーとしての毛髪サンプルの使用は、爪サンプルと比較して成長速度が非常に変動すること、毛髪の生物学を知る必要性、外部汚染の可能性があることから議論されてきました。 一方、生体指標としての爪サンプルの使用には、外部汚染の可能性が低く、毛髪サンプル (6 ～ 36 mm/月) と比較して成長速度がはるかに遅い (0.9 ～ 1.5 mm/月) ため、より多くの利点があります17。 したがって、この研究は、主に地下水中のヒ素濃度に曝露されているイラン西部のカブードラハン郡の汚染された農村地帯に住んでいた個人における、飲料水の摂取によるヒ素曝露と爪のヒ素レベルとの関連性を評価することを目的とした。非常に低含有量から高含有量までの飲料水の供給源。

この横断研究では、イラン・ハマダーン州カブードラハン県西部の農村地域に住む89人の健康な参加者から爪のサンプルが採取されました。 調査地域における参加者の爪のサンプリングのために選択された村の位置を図 1 に示します。調査地域の位置と爪のサンプリングのために選択された村は、ArcGIS バージョン 10.4.1 を使用して取得されたことに注意してください。 (図1)。 地下水源中のヒ素のレベルは、参加者の爪のサンプリングを行う村を選択するための基礎として使用されました。 したがって、ヒ素の影響を受けた 3 つの村を暴露グループとみなし、ヒ素濃度の低い 3 つの村を参照グループとみなしました。 これらの地域では、地下水源が農業および飲料需要のための主な水供給源であると考えられています。 現在の調査に参加した全員が地方に住んでおり、職業上ヒ素にさらされていない参加者であったことは注目に値する。 また、選択された地域の地域経済は主に農業と畜産業に基づいています。 次に、性別、身長、体重、年齢、喫煙などの情報も、自己申告アンケートを使用してすべての参加者から得られました。 ボディマス指数（BMI）は、体重（キログラム）を身長（平方メートル）で割ったものとして計算されました。 研究プロトコールはハマダン医科大学の倫理委員会によって審査および承認され（承認番号 IR.UMSHA.REC.1397.916）、すべての実験は関連するガイドラインおよび規制に従って行われました。 アンケートに記入する前に倫理的許可を得るため、すべての参加者および/または法的保護者からインフォームドコンセントを得ました。 最後に、参加者全員に、自分たちの情報は機密として保持されることが保証されました。

調査地域の場所と爪のサンプリングのために選択された村 (ArcGIS バージョン 10.4.1)。

調査対象地域の各村の公共配水システムネットワークから合計 6 つの地下水サンプルをヒ素測定用のポリエチレンボトルに収集し、65% HNO3 を 1 滴加えました。 その後、酸性化した地下水サンプルはヒ素分析まで冷蔵庫に保管されました。 また、研究対象地域の個人から 89 個の生物学的爪サンプルを収集しました。 ヒ素に汚染された村に住む参加者から40本の爪のサンプルが採取され、残りは飲料水を介してヒ素にさらされていませんでした。 次に、ステンレス鋼の爪切りを使用して爪のサンプルを切り、測定するまでビニール袋に保管しました。

HNO3 と H2O2 による簡単な消化法を使用して、爪サンプル中のヒ素濃度を測定しました。 約 0.02 ～ 0.05 g の爪サンプルを秤量し、4 mL の HNO3 (65%) と 2 mL の H2O2 (30%) を含む 25 mL ビーカーに加えました。 サンプルの入ったビーカーを 80 ～ 90 °C のホット プレート上に置き、一定量の HNO3 を加えて加熱を続けると、サンプルの色が暗褐色から淡黄色に変化しました。 サンプルの最終体積が１ｍＬに達した時点で加熱操作を停止した。 サンプルを冷却した後、2 ～ 3 mL の蒸留水を各サンプルに加え、調製した溶液をミリポア フィルターに通し、最終的に 5 mL の体積に達しました。 最後に、飲料水と爪サンプル中のヒ素の濃度が ICP-OES 装置によって測定されました 22,23。

飲料水および爪サンプル中のヒ素含有量は、ICP-OES 装置を使用して測定されました。 ＨＮＯ ３ （６５％）は、ＳｕｐｒａｐｕｒＲグレードであり、Ｍｅｒｃｋ Ｃｏ（ドイツ）から入手した。 他のすべての試薬は Fluka (Sigma-Aldrich、スイス) から購入し、分析グレードのものでした。 データの精度を達成するために、地下水、爪、標準溶液（標準溶液 Fluka-51844、Sigma-Aldrich、スイス）およびブランクサンプル中のヒ素レベルを 3 回検査しました。 すべての反復測定において、実験中に 5 ～ 10% の相対標準偏差が達成されました 3,24。 さらに、結果をさらに検証するために、比較に使用できる人間の爪で認定された参照物質はありませんでした。

本研究では、SPSS V.16.0 ソフトウェアを使用して、p < 0.05 の有意水準でデータの統計計算を実行しました。 データの正規性を確認するために、1 サンプルのコルモゴロフ – スミルノフ検定が適用されました。 爪サンプル中のヒ素濃度は正規分布していなかったため、マン・ホイットニー U 検定などのノンパラメトリック統計検定を使用して、参加者のグループ間の有意差を見つけました。 カイ二乗検定を適用して、2 つの参照グループと曝露グループの BMI、性別、喫煙習慣などのカテゴリ変数の分布を比較しました。 また、独立した t 検定を使用して、2 つの参照グループと曝露グループの年齢変数を比較しました。 地下水中のヒ素濃度と爪サンプルとの関連性は、年齢、BMI、性別、喫煙習慣を調整した単一および多重線形回帰モデルを使用して評価されました。 爪サンプル中のヒ素濃度の最大値、最小値、平均値、標準偏差を含む記述統計は、Excel 2013 ソフトウェア (Microsoft Office) を使用して計算されました。

この論文の著者全員が貢献者として認められ、リストされており、彼らが原稿の最終版を確認しています。

本研究では、ヒ素汚染地域に住んでいた個人の飲料水摂取によるヒ素への人間の曝露を評価するためのバイオマーカーとして爪のサンプルが使用されました。 個人は、ヒ素濃度が 0.179 µg/L の参照グループ (領域 D、E、および F) と、地下水源のヒ素濃度が異なるばく露グループ (領域 A = 200 µg/L) に割り当てられたことを指摘しておく必要があります。 、領域 B = 76.6 μg/L、領域 C = 74.5 μg/L)。 この研究を行うために、私たちは 89 個の爪のサンプルを収集しました。そのうち 40 個のサンプルはヒ素に汚染された村に住む参加者からのもので、残りはヒ素に曝露されていない参加者からのものでした。 表 1 は、カブードラハン郡の暴露村および参照村から収集された参加者の爪サンプル中のヒ素レベル (μg/g) を示しています。 結果によると、爪サンプル中のヒ素の平均値は 1.78 μg/g (0.13 ～ 10.33 μg/g の範囲) であり、参照領域のヒ素値 (0.43 μg/g) と比較して、調査対象領域の暴露領域では観察されました。 、範囲は 0.1 ～ 1.21 μg/g)。 これは、爪サンプル中のヒ素の平均濃度、最小濃度、最大濃度が、ヒ素汚染地域に住んでいる参加者のほうが、ヒ素にさらされていない地域に住んでいる参加者よりも高かったことを意味します。 本研究の結果によると、飲料水を介してヒ素に曝露された村では、爪のサンプルの85％に通常レベルを超えるヒ素が含まれていたが、ヒ素に曝露されていない村では、爪のサンプルの28.57％でヒ素濃度が高かった。正常値よりも。

年齢、性別、BMI、喫煙習慣など、研究対象となった参加者の一般的特性を表 2 にまとめました。見てわかるように、ヒ素暴露グループの年齢平均 (34.8 ± 10.39 歳) は、ヒ素暴露グループの平均年齢 (34.8 ± 10.39 歳) よりも有意に高かったです。参照グループ（29.51 ± 10.8 歳）（p = 0.022）。 また、性別、喫煙、BMI などの変数に関して 2 つのグループ間に有意差はありませんでした (p ~ 0.05)。 この地域の 2 つの曝露群と参照群の飲料水と爪サンプル中のヒ素レベルの間には、有意差が示されました (p < 0.001) (表 2)。

粗い線形回帰モデルを使用した、飲料水源中のヒ素濃度と爪サンプルの関連性の結果を表 3 に示します。単純な線形回帰モデルでは、爪サンプル中のヒ素濃度と変数との間に有意な関係が示されました。これには、性別（p = 0.019）および汚染された飲料水によるヒ素の経口摂取（p < 0.001）が含まれます。 その結果、女性は男性に比べて爪サンプル中のヒ素濃度が有意に低いことが示されました（β = − 0.248、95% CI − 0.843、− 0.078）。これは他の研究の結果と一致しています 25,26。 同様に、地下水中のヒ素濃度が 1% 増加すると、爪サンプルのヒ素濃度が 60% (β = 0.595、95% CI 0.781、1.413) 増加します。 爪のヒ素と年齢や喫煙習慣などの変数との間に有意な関係は見出されませんでしたが、結果は、爪サンプル中のヒ素濃度が加齢（β = 0.199、95% CI 0.00、0.035、p = 0.062）および喫煙（β = 0.192、95% CI − 0.043、1.011、p = 0.071)。 この結果はまた、肥満の参加者は正常体重の参加者と比較して爪のヒ素が少ないことも示しました（β = − 0.125、95% CI − 0.069、0.018、p = 0.242）。

年齢、性別、BMI、喫煙、ヒ素への曝露を調整した多変量線形回帰モデルでは、性別および飲料水中のヒ素レベルを含む変数は、爪サンプルのヒ素と有意に関連していました（p < 0.05）。 さらに、この段階では、地下水ヒ素の 1% 増加は、爪サンプル中のヒ素の 56% ((β = 0.558) 増加と関連していました。女性参加者の爪サンプル中のヒ素濃度は、男性よりも低かったまた、爪サンプル中のヒ素濃度と、年齢、BMI、喫煙などの変数との間に統計的に有意な関係は見つかりませんでした。ただし、単純な線形回帰で得られた結果と同様に、年齢が増加するにつれて (β = 0.152)、喫煙 (β = 0.002)、BMI の減少 (β = − 0.152) により、爪サンプルのヒ素濃度は増加しました。

ここ数十年、さまざまな経路からの汚染物質への人体曝露のリスクを評価するための疫学および毒物学研究における生物学的モニタリングに関する研究が非常に重要になっています。 この点に関して、ヒ素は環境や飲料水源に広範囲に存在し、人間の健康に悪影響を与える可能性があるため、生物学的モニタリングは、自然経路および人為的経路を介したヒ素への曝露を評価するための貴重なツールとして使用されています15。 16.

ヒ素による地下水汚染の主な原因は、石灰岩、ジュラ紀の砂岩、泥灰土、変成岩、頁岩で構成される調査地域の地質構造に起因すると考えられます。 また、この地域の大部分はサナンダジュ・シルジャン帯の北西部とザグロス衝上帯の南西部に属している27,28。 飲料水源におけるヒ素汚染のもう一つの理由は、その地域がクルディスタン州に近いことである。クルディスタン州では、一部の地域で飲料水源におけるヒ素の存在が報告されている29,30。 本研究の結果によると、爪サンプル中のヒ素の平均濃度、最小濃度、最大濃度は、ヒ素に汚染されていない地域に住んでいる参加者よりも、ヒ素汚染地域に住んでいる参加者の方が高かった。

カナダのノバスコシア州の足の爪サンプルと飲料水供給源に含まれるヒ素含有量の空間変動と地域分布が、Dummerらによって調査された。 彼らはまた、飲料水源中の高濃度のヒ素に関連する地質学的および環境的特性も評価しました。 この研究の結果に基づくと、飲料水サンプル中のヒ素のレベルは、この方法の検出限界 (478 μg/L) 未満でした。 彼らの研究では、ヒ素による飲料水源の汚染は調査地域の地質構造に起因すると述べています。 また、この研究では、足の爪サンプル中の高レベルのヒ素と飲料水供給との間に密接な関連性が観察され、これは我々の研究結果と一致しています31。

その結果によると、ヒ素に暴露された村では、爪のサンプルの 85% に正常値を超えるヒ素が含まれていたのに対し、ヒ素に暴露されていない村では、爪のサンプルの 28.57% で正常値よりも高いヒ素濃度が検出されました。

176の生体サンプル（毛髪、尿、爪）中のヒ素濃度を分析したチャクラボルティらの研究の観察結果では、69人の参加者にはヒ素曝露による皮膚病変があり、残りの参加者にはヒ素による皮膚はなかったことが示された。病変。 この研究では、毛髪、爪、尿サンプル中の正常なヒ素レベルは、それぞれ 20 ～ 200 μg/kg、20 ～ 500 μg/kg、および < 100 μg/L であると報告されました。 彼らは、生物学的サンプルの 100% でヒ素濃度が正常値を超えていることを発見しました 22。

年齢、性別、BMI、喫煙、ヒ素への曝露を調整した多変量線形回帰モデルでは、性別および飲料水中のヒ素レベルを含む変数は、爪サンプルのヒ素と有意に関連していました（p < 0.05）。

シュミットらによる研究では、中国のモンゴル地域でヒ素曝露のバイオマーカーとして人間の爪のサンプルが使用されました。 この研究では、32 人の参加者から爪のサンプルが収集されました。 合計 19 名が飲料水を通じて高濃度ヒ素 (264 ～ 648 μg/L) に曝露され、13 名の被験者が低濃度ヒ素 (0.3 ～ 9.8 μg/L) に曝露され、対照群となりました。 この研究では、飲料水中のヒ素濃度と爪サンプルの間に有意な関係が判明しました。 また、この研究の結果に基づくと、男性の方が水の摂取量が多かったために爪サンプル中のヒ素濃度が女性の参加者より高かったが、これは本研究の結果と一致している32。

別の研究では、ノバスコシア州の飲料水源中のヒ素濃度と足の爪サンプルの間の相関関係がYuらによって調査された。 足の爪切りサンプルのヒ素分析のために、35 ～ 69 歳の合計 960 人の「男性と女性のサンプル」が選択されました。 この研究では、年齢、性別、飲料水源、治療用途、民族、教育レベル、雇用状況、世帯収入、喫煙状況、身体活動量、BMIなどの情報を参加者全員にアンケートで尋ねました。 彼らの研究結果に基づいて、飲料水源のヒ素濃度と足の爪サンプルの間に統計的に有意な関連性が観察され（r = 0.46、p < 0.0001）、これは我々の研究結果と一致しています。 この研究の結果はまた、女性（β = − 0.132、95% CI − 0.238、− 0.026、p 値 = 0.0268）、肥満者（β = -0.263、95%）の足の爪サンプル中のヒ素のレベルが低いことを示しました。 CI − 0.386、− 0.141、p < 0.0001）およびより高いレベルの世帯収入を持つ参加者（β = − 0.152、95% CI − 0.292、− 0.011、p = 0.0345）は、他の参加者より有意に低かった33。

Liuらによって行われた研究では、ヒ素摂取と人間の健康リスクとの関連性が、毛髪、爪、尿、唾液などのバイオマーカーを使用して評価された。 彼らの調査の結果、生体サンプル中のヒ素濃度は、男性、高齢者、皮膚病変のある参加者では他の参加者よりも高かったことが示されました。 また、女性は男性よりもメチル化能力が高いため、生体サンプル中のヒ素濃度は女性の方が低いと報告しており、これは本研究の結果と一致しています26。

今回の研究結果は、飲料水の摂取によるヒ素曝露を評価するためのバイオマーカーとして爪サンプルを使用することが適切であることを示した。 爪のサンプルには、多量の硬タンパク質（ケラチンなど）とスルフヒドリル基が含まれています。 ヒ素はこれらのスルフヒドリル基への結合に対して強い親和性を持っていることを指摘しておく必要があります。 また、豊富な血液源から生殖爪基質が供給されるため、摂取後すぐに爪サンプル中にヒ素が沈着します。 成長速度が遅いこと、他のバイオマーカー (毛髪サンプルなど) と比較して外部汚染の可能性が低いこと、収集が容易であること、および非侵襲性であることから、爪サンプル (指の爪と足の爪のサンプル) の使用は適切な方法であると結論付けることができます。環境汚染物質への曝露を研究するためのバイオマーカーは増加傾向にあります18,32。 さまざまな研究で測定された爪サンプル中のヒ素のレベルが表 4 に報告されていることに注意してください。

現在の研究は、汚染された地下水の摂取によるヒ素曝露のヒトのバイオマーカーとして爪のサンプルを使用することを目的としていました。 私たちの結果は、地下水源や爪における高濃度のヒ素の発生に地質構造が重要な役割を果たしているということを示しました。 また、この研究では、ヒ素汚染地域と参照地域から採取されたサンプルの50％と4.08％の爪のヒ素含有量が、それぞれ爪の通常のヒ素値（0.43～1.08μg/g）よりも高かったことが示された。 調整重回帰の結果に基づくと、ヒ素汚染地域に住む参加者の爪中のヒ素濃度は、参照地域の個人の爪中のヒ素濃度よりも有意に高かった(p < 0.001)。 さらに、爪サンプル中のヒ素と性別との間に統計的に有意な関連性が示された。 女性は男性よりも爪中のヒ素の値が有意に低かった(p = 0.037)。 爪のヒ素含有量は、年齢、喫煙習慣、BMIなどの他の変数によって有意な影響は受けませんでした（p > 0.05）。 この研究で達成された結果の概要に基づいて、そのような研究の利点と医学における応用を向上させるために、より多くの参加者によるさらなる研究が推奨されることが判明しました。

現在の研究には注意すべき大きな制限がいくつかあります。 まず、財政的制約のため、分析された爪サンプルの数が少なく、それにより分析の精度が低下しました。 第二に、飲料水源中のヒ素濃度と、毛髪、尿、血液、農作物などの他のバイオマーカーとの関係を調査しませんでした。 第三に、我々は爪サンプル中の総ヒ素の値のみを測定し、有機ヒ素と無機ヒ素の値を個別に特定しませんでした。 本研究では、飲料水源中のヒ素濃度とバイオマーカーとしての爪サンプルの関係を調査しようとしましたが、ヒ素の生体蓄積（毛髪、尿、唾液、および血液サンプル中の蓄積）の関係を調査するには、より多くのサンプルサイズを使用した将来の研究が必要です。 、ダイエットと健康。

すべてのデータは原稿本文に報告されています。

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この研究は、ハマダン医科大学からの資金援助を受けました（助成番号：980120241）。 研究プロトコルは倫理委員会によって承認されました (IR.UMSHA.REC.1397.916)。 また、この研究で提示されたデータは博士号から得られたものです。 イラン西部ハマダーン州の農村地域の飲料水資源中のヒ素の健康リスク評価に関する論文。 すべてのデータは原稿本文で報告されていることに注意してください。

イラン、ハマダーンのハマダーン医科大学公衆衛生学部環境衛生工学科および健康科学研究センター

レザ・ショクーヒ、モハマド・カザエイ、アブドルモタレブ・サイド＝モハマディ、ザーラ・トルクシャヴァンド

イラン、テヘランのシャヒード・ベヘシュティ医科大学公衆衛生安全学部疫学部

マヌーチェル カラミ

ハマダーン医科大学健康科学研究センター（イラン、ハマダーン）

サルマン・カザエイ

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RS: 概念化、方法論、検証、形式的な分析、調査、リソース、および執筆 - オリジナルの草案、執筆 - レビューと編集、監督、資金調達、プロジェクト管理。 Mo.K.: 方法論、検証、形式分析、執筆 - レビューと編集。 Ma.K.: 方法論、検証、形式分析、執筆 - レビューと編集。 AS: 執筆—レビューと編集。 SK: 形式的な分析、執筆 - レビューと編集。 ZT: 概念化、方法論、検証、形式分析、リソース、執筆 - 原案、執筆 - レビューと編集。 著者全員が原稿をレビューしました。

ザーラ・トルクシャバンドへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Shokoohi、R.、Khazaei、M.、Karami、M. 他ヒ素で汚染された飲料水への人間の曝露のバイオマーカーとしての爪サンプルの応用。 Sci Rep 12、4733 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-08845-2

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受信日: 2022 年 1 月 8 日

受理日: 2022 年 3 月 15 日

公開日: 2022 年 3 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-08845-2

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